Nel 1500 viene chiamato a Spello da Troilo Baglioni, priore della Canonica di Santa Maria Maggiore, Bernardino di Betto Betti, più noto come Pinturicchio (1452-1513) per affrescare le pareti di una delle cappelle della chiesa. Il pittore realizzò un ciclo di affreschi unico nel panorama artistico del borgo, caratterizzato da equilibrio prospettico, monumentalità dell’architettura e grazia delle figure. Gli affreschi hanno come tema le Storie di Maria e dell’infanzia di Gesù: il Pinturicchio dipinse nella parete di sinistra l’Annunciazione, in quella centrale la Natività, nella parete di destra la Disputa di Gesù fra i Dottori e le quattro Sibille nelle vele della volta. La parete a sinistra mostra l’Annunciazione, ambientata davanti a un maestoso loggiato rinascimentale, il cui pavimento geometrico ridotto in prospettiva conduce l’occhio dello spettatore in lontananza dove si apre un paesaggio ricco di dettagli. La dolce figura di Maria è rappresentata nell’atto di leggere, sorpresa dall’angelo che si avvicina benedicendola e porgendole il giglio bianco, simbolo della sua purezza virginale; in alto appare l’Eterno in una mandorla composta di cherubini ed invia la colomba dello Spirito Santo. La parete centrale mostra l’Adorazione dei pastori, con l’arrivo del corteo dei Magi sullo sfondo. La scena è ambientata nel prato davanti alla capannuccia. I pastori sono di fronte al Bambino in ginocchio, in attitudine adorante e recano doni. La parete destra è decorata con la Disputa di Gesù coi Dottori. La scena è ambientata in uno spazio aperto, di fronte al tempio di Salomone a Gerusalemme. Al centro, circondato da sacerdoti e dotti che lo ascoltano con attenzione e stupore, si scorge il giovane Gesù; sul lato destro della composizione, Maria e Giuseppe entrano nel tempio.